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猪用生物制品及相关猪源原辅质料中非洲猪瘟病毒核酸检测要领

宣布时间：2019/5/21 13:57:07 宣布者：农业农村部

猪用生物制品及相关猪源原辅质料中

非洲猪瘟病毒核酸检测要领

1 适用规模

1.1猪用及接纳猪源原辅质料制备的生物制品制品及半制品。。。。。。。

1.2猪源毒种。。。。。。。

1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。。。。。。。

1.4其他猪源原辅质料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。。。。。。。

2 取样和处置惩罚

2.1 疫苗

2.1.1 活疫苗取至少2瓶样品，，，，，，，，按瓶签注明头份用相宜稀释液划分稀释成10头份/0.2ml，，，，，，，，等量混淆，，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.1.2 灭活疫苗取至少2瓶样品，，，，，，，，等量混淆后举行以下处置惩罚。。。。。。。

2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗取36 ml混淆疫苗，，，，，，，，加入正戊醇4.0 ml，，，，，，，，充分振荡混淆1分钟，，，，，，，，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，，，，，，，，直至油相和水相疏散。。。。。。。取水相举行核酸提取。。。。。。。

2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗

2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗取混淆疫苗5.0 ml，，，，，，，，摇匀，，，，，，，，加入0.25 g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），，，，，，，，放入摇床（200 r/min）37℃解离1小时，，，，，，，，5000 r/min离心10分钟，，，，，，，，取上清液举行核酸提取。。。。。。。

2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗直接取混淆样品举行核酸提取。。。。。。。

2.2 其他生物制品和半制品冻干类制品，，，，，，，，按活疫苗举行取样和处置惩罚；；；；；；；液体制品及半制品，，，，，，，，取至少2份（瓶）样品，，，，，，，，等量混淆，，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.3 猪源毒种取至少2支毒种。。。。。。。冻干毒种，，，，，，，，按冻干前体积复溶后等量混淆，，，，，，，，取混淆液举行核酸提取！。。。。；；；；；；；非冻干毒种，，，，，，，，等量混淆后直接取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.4 猪源细胞除尚有划定外，，，，，，，，取至少2瓶细胞浓度不少于10^7.0个细胞/ml的细胞悬液举行核酸提取。。。。。。。

2.5 其他猪源原辅质料

2.5.1 猪组织每种组织，，，，，，，，划分取样和处置惩罚。。。。。。。取不少于2.0 g组织，，，，，，，，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，，，，，，，，70℃灭活30分钟，，，，，，，，4℃下以2000～3000 g离心10分钟，，，，，，，，取上清液举行核酸提取。。。。。。。

2.5.2 猪血清每批血清取至少2个最小包装的样品，，，，，，，，等量混淆，，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.5.3 猪胰酶干粉状胰酶，，，，，，，，取至少2份样品，，，，，，，，凭证使用情形划分派制成不低于2.5%浓度的溶液，，，，，，，，等量混淆，，，，，，，，取混淆液举行核酸提取！。。。。；；；；；；；液体胰酶，，，，，，，，取至少2个最小包装的样品，，，，，，，，等量混淆，，，，，，，，取混淆液举行核酸提取。。。。。。。

2.5.4 其他猪源衍生物固体、液体或干粉状猪源衍生物，，，，，，，，可划分按组织、血清或干粉状胰酶的要领举行取样和样品处置惩罚。。。。。。。

3 核酸提取

3.1 试剂和器材

3.1.1 试剂凭证核酸提取要领确定，，，，，，，，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l 柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。。。。。。。

3.1.2 仪器核酸含量测定仪；；；；；；；常温台式离心机；；；；；；；旋涡振荡器；；；；；；；水浴锅；；；；；；；微量移液器1套（最大宗程划分为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）。。。。。。。

3.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。。。。。。。

3.2 操作程序（TRIZOL法），，，，，，，，也可以选择其他等效核酸提取要领提取样品中的DNA。。。。。。。

3.2.1 取样品250 ?l，，，，，，，，加入750 ?l Trizol，，，，，，，，倒置混匀，，，，，，，，室温安排5分钟。。。。。。。

3.2.2 加入200 ?l氯仿，，，，，，，，充分混匀，，，，，，，，室温安排10 分钟，，，，，，，，4℃下以12000 g离心15 分钟。。。。。。。

3.2.3 弃去上清液，，，，，，，，加入220 ?l无水乙醇，，，，，，，，倒置混淆，，，，，，，，15～30℃安排2～3分钟，，，，，，，，2～8℃以2000 g离心5分钟，，，，，，，，沉淀物为DNA。。。。。。。

3.2.4 弃去上清液，，，，，，，，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 柠檬酸钠750 ?l洗涤DNA，，，，，，，，15～30℃安排30分钟，，，，，，，，2～8℃以2000 g离心5分钟。。。。。。。重复一次。。。。。。。

3.2.5 加入75%乙醇1.2 ml，，，，，，，，重悬DNA沉淀，，，，，，，，15～30℃安排20分钟，，，，，，，，4℃2000 g离心5分钟。。。。。。？？？？？？？？芍馗匆淮，，，，，，，，充分洗涤DNA沉淀。。。。。。。

3.2.6 弃去上清液，，，，，，，，洞开离心管管口，，，，，，，，在空气中干燥5～10分钟，，，，，，，，加入30～50 μl的无核酸酶灭菌水消融DNA，，，，，，，，－20℃以下生涯备用。。。。。。。

3.3 注重事项

3.3.1核酸提取试剂具有侵蚀和强变性能力，，，，，，，，应做好小我私家防护，，，，，，，，佩带手套、口罩和护目镜，，，，，，，，避免液体飞溅到皮肤和眼睛。。。。。。。

3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，，，，，，，，要避免样品之间相互污染，，，，，，，，最好使用带滤芯的枪头，，，，，，，，且每次吸收取液体时均需替换枪头。。。。。。。

3.3.3为避免核苷酸降解，，，，，，，，应阻止核酸酶污染，，，，，，，，使用的耗材均需无核酸酶。。。。。。。

3.3.4做好剩余样品的无害化处置惩罚及操作台面的消毒处置惩罚。。。。。。。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处置惩罚，，，，，，，，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处置惩罚，，，，，，，，操作台面使用1%卫可擦拭。。。。。。。

3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，，，，，，，，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，，，，，，，，避免污染。。。。。。。

4 检测

下列两种要领可任选其一。。。。。。。

4.1 实时荧光定量PCR检测法

4.1.1 试剂和器材

4.1.1.1 试剂

4.1.1.1.1 荧光定量PCR试剂本操作中以Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays kit为例，，，，，，，，也可选用其他荧光定量PCR试剂。。。。。。。

4.1.1.1.2 扩增引物及探针

扩增引物：

ASF-05-Zsak-1466F（10 ?mol/ L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'

ASF-05-Zsak-1528R（10 ?mol/ L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'

探针ASF-05-Zsak-1486prob (10 ?mol/ L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'

4.1.1.1.3 无核酸酶的灭菌水 PCR级别。。。。。。。

4.1.1.2 仪器荧光定量PCR仪；；；；；；；微量移液器1套（最大宗程划分为10 ?l、100 ?l、200 ?l、1000 ?l）。。。。。。。

4.1.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）、一次性乳胶手套。。。。。。。

4.1.2 操作程序

4.1.2.1 样品DNA制备凭证前述要领举行核酸提取。。。。。。。

4.1.2.2 反应系统的配制配制比样品数目至少多4个的反应系统，，，，，，，，同时设置强阳性、弱阳性和阴性比照。。。。。。。在强阳性和弱阳性比照反应管中划分加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3 ?l，，，，，，，，在阴性比照反应管中加入3?l无核酸酶灭菌水。。。。。。。每个PCR反应管中应包括以下因素：

因素	体积（?l）
2×ABI TaqMan Gene ExpressionMix	10
ASF-05-Zsak-1466F（10 ?mol/ L）	1
ASF-05-Zsak-1528R（10 ?mol/ L）	1
探针(10 ?mol/ L)	0.8
DNA	3
无核酸酶灭菌水	4.2
	总量20

4.1.2.3 反应程序将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性比照反应管放在荧光定量PCR仪中，，，，，，，，凭证以下程序举行扩增：50℃2分钟，，，，，，，，95℃5分钟，，，，，，，，95℃15秒，，，，，，，，58℃退火延伸1分钟，，，，，，，，45个循环（荧光信号网络在此阶段每次循环的退火延伸时举行）。。。。。。。

4.1.2.4 效果判断

4.1.2.4.1 阈值设定试验操作竣事后，，，，，，，，确定Ct值。。。。。。。Ct值为每个样品反应管内荧光信号抵达设定阈值时所履历的循环数。。。。。。。

阈值设定原则：凭证仪器噪声情形举行调解，，，，，，，，以阈值线恰恰凌驾阴性比照扩增曲线的最高点为准。。。。。。。

4.1.2.4.2 质控标准

比照组的检测效果应切合以下情形，，，，，，，，此次检测方为有用：

阴性比照无Ct 值，，，，，，，，且无扩增曲线。。。。。。。

强阳性比照的Ct 值应在18～22之间，，，，，，，，并泛起典范的扩增曲线。。。。。。。弱阳性比照的Ct 值应在33～35之间，，，，，，，，并泛起典范的扩增曲线。。。。。。。

4.1.2.4.3 判断

阴性：无Ct值，，，，，，，，且未泛起扩增曲线，，，，，，，，判断为样品中无ASFV核酸。。。。。。。

阳性：Ct值≤40，，，，，，，，且泛起典范的扩增曲线，，，，，，，，判断为样品中保存ASFV核酸。。。。。。。

可疑：Ct值>40，，，，，，，，且泛起典范扩增曲线，，，，，，，，判断为可疑，，，，，，，，应重检。。。。。。。重检后，，，，，，，，Ct值≤40且泛起典范扩增曲线者判为阳性，，，，，，，，其他情形均判断为阴性。。。。。。。

4.2 通俗 PCR检测法

4.2.1 试剂和器材

4.2.1.1 试剂

4.2.1.1.1 PCR试剂 10×PCR缓冲液（含25 mmol/l Mg²⁺），，，，，，，，DNA扩增酶，，，，，，，，dNTP预混液。。。。。。。

4.2.1.1.2扩增引物

primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；；；；；；；

primer PPA-2（10 μmol/L）：5'- CCCTGAATCGGAGCATCCT-3' (下游引物)。。。。。。。

4.2.1.1.3 DNA分子量标准品 DL500。。。。。。。

4.2.1.1.4 TAE电泳缓冲液配制要领见《电泳液标准配制流程》。。。。。。。

4.2.1.1.5 1%琼脂糖凝胶板在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，，，，，，，，加热融化，，，，，，，，加入5.0 μl (10 mg/ml)溴化乙锭，，，，，，，，混匀，，，，，，，，倒入水平安排的凝胶盘中，，，，，，，，胶板厚度达5.0 mm左右。。。。。。。凭证样品数目选用相宜的梳子。。。。。。。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，，，，，，，，放入电泳槽中，，，，，，，，加1×TAE缓冲液淹没胶面。。。。。。。

4.2.1.2 仪器 DNA扩增仪，，，，，，，，稳压稳流电泳仪，，，，，，，，水平电泳槽，，，，，，，，凝胶成相系统（或紫外透射仪），，，，，，，，微量移液器1套。。。。。。。

4.2.1.3 耗材 1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、无菌吸头（0～10 ?l、0～200 ?l、100～1000 ?l）。。。。。。。

4.2.2 操作程序

4.2.2.1 样品DNA制备凭证前述要领举行核酸提取。。。。。。。

4.2.2.2 反应系统的配制配制比样品数目至少多3个的反应系统，，，，，，，，同时设立阳性和阴性比照。。。。。。。在阳性比照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0 ?l，，，，，，，，在阴性比照反应管中加入2.0 ?l无核酸酶灭菌水。。。。。。。每个PCR反应管中应包括以下因素：

因素	体积（?l）
10×PCR缓冲液	2
DNA 扩增酶	1
dNTP	0.5
PPA-1 (10 μmol/L)	1
PPA-2 (10 μmol/L)	1
DNA	2
无核酸酶灭菌水	12.5
	总量20

4.2.2.3 反应程序将所有待检样品及阳性和阴性比照反应管放在PCR仪中，，，，，，，，凭证以下程序举行扩增：94℃2分钟，，，，，，，，94℃30秒，，，，，，，，60℃30秒，，，，，，，，72℃30秒，，，，，，，，35个循环；；；；；；；72℃10分钟。。。。。。。4℃生涯。。。。。。。

4.2.2.4 PCR扩增产品剖析取PCR扩增产品10 ?l，，，，，，，，加6×加样缓冲液2.0 ?l，，，，，，，，混匀，，，，，，，，用1.5%琼脂糖凝胶对混淆物举行电泳剖析，，，，，，，，电压120V，，，，，，，，电流50 mA，，，，，，，，电泳时间30分钟。。。。。。。电泳竣事后，，，，，，，，用凝胶成像系统照相，，，，，，，，纪录检测效果。。。。。。。

4.2.2.5 效果判断

4.2.2.5.1 质控标准

比照组的检测效果应切合以下情形，，，，，，，，此次检测方为有用：

阴性比照应不泛起257bp的特异性条带。。。。。。。

阳性比照应泛起257bp的特异性条带。。。。。。。

4.2.2.5.2 判断

阳性：待检样品泛起与阳性比照巨细一致的扩增条带，，，，，，，，判断为非洲猪瘟病毒核酸阳性，，，，，，，，扩增产品可通过DNA测序进一步确定基因型。。。。。。。

阴性：待检样品未泛起与阳性比照巨细一致的扩增条带，，，，，，，，判断为非洲猪瘟病毒核酸阴性。。。。。。。

4.3 注重事项

4.3.1检测历程中应遵照PCR实验分区原则，，，，，，，，即应区分试剂配制区、样本处置惩罚区、核酸扩增区。。。。。。。

4.3.2应阻止在含有靶序列的区域中使用引物，，，，，，，，避免污染靶序列。。。。。。。

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